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FAQs
ChromoTek 常见问题解答
作者:Morey 发布时间:2017-03-13 点击次数:937

  1、GFP-Trap®可识别的 GFP 衍生物类型有哪些?

  (1) eGFP, wtGFP, GFP S65T

  (2) TagGFP

  (3) eYFP, YFP, Venus, Citrin

  (4) CFP

  不能识别:TurboGFP,所有的 RFPs

  2、RFP-Trap®可识别的 RFP 衍生物类型有哪些?

  (1) mRFP

  (2) mCherry

  (3) mOrange

  (4) mPlum

  (5) mRuby

  (6) mKate2

  不能识别:DsRed、mRFPruby、TagRFP、所有 GFPs

  3、Nano-Trap® (GFP-Trap® / RFP-Trap®) 的结合能力如何?

  Nano-Trap®的结合能力取决于珠子。每 10μL 浆液,琼脂糖珠可结合 2~3μg GFP,磁性颗粒可结合 0.25-~0.5μg GFP。

  4、可以从 GFP-Trap 洗脱结合蛋白么?

  关于定量洗脱,可以将样品至于 SDS 上样缓冲液中 95℃煮 10min(详见 protocol),或者在 0.2 M 的 甘氨酸(pH2.5)中孵化 0.5~2min,随后用 0.1 体积的 1M Tris 碱中和。

  5、是否可以从 GFP-Trap 洗脱出自然状态的结合蛋白,比如,在凝胶迁移实验或功能分析实验中?

  可以尝试洗脱游离的 GFP。但是,请注意,这种方法,不能定量洗脱出目标融合蛋白。

  6、怎样才能避免非特异性的蛋白与 GFP-Trap 交互作用而结合?

  关键操作步骤,是在孵化液中稀释洗涤剂的浓度。我们建议,洗涤剂为终浓度 0.1%(如 NP-40 或 TX-100),

  且最终体积不少于 0.4mL。另外,我们建议,要测定各种洗涤缓冲液的盐浓度,使其范围在 150mM-500mM

  范围内,以去除非特异性结合的亲水性蛋白。

  7、在 binding 过程中,N-端与 C-端 GFP 融合蛋白之间是否存在差异?

  GFP-Trap®对 C-末端的 GFP 融合蛋白的亲和力稍高,若要消除这种差异,可以加长孵化时间(1-2h 取 代 15-30min)

  8、是否可以在组织样品(即变性缓冲液)中直接纯化 GFP 标记的融合蛋白?

  原则上,GFP-Trap®即使在恶劣的缓冲条件下(如,RIPA 缓冲液,含 0.1%SDS 或 1M 尿素),也非常 稳定。

  9、可结合的 GFP-Trap®珠的 GFP 结构,是否有大小限制?

  无。

  10、如果在洗脱液中,有剩余的背景怎么办?

  建议使用 Chromotek 的 blocked particles(bab-20 or bmp-20)对样品进行预处理。


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