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流式细胞仪的原理和用途
作者:Moreybio 发布时间:2017-01-07 点击次数:2083

流式细胞仪测量的数据是相对值,因此需要在使用前对系统进行校准或标定。流式细胞仪的校准有二个目的,即仪器的准直调整和定量标度。通常使用标准微球作为非生物学标准样品,鸡血红细胞做为生物学标准样品。

3 主流流式细胞仪型号及其特性介绍

目前拥有市场较大份额的公司是美国的BD(Becton-Dickinson)公司、Beckman-Coulter公司(原名称Coulter)和德国的Partec公司。

3.1 BD公司流式细胞仪介绍 BD公司生产的流式细胞仪都冠以FACs(fluorescence activated cell sorter),即荧光激活细胞分选器。其型号种类比较齐全,如早期的FACSort、FACS Canto、FACSean。现在市场上供应的型号有五种:FACSCount(小型流式细胞仪)、FACS CAlibur(流式细胞仪)、FACSA ria(流式细胞分选仪)、FACSV antage SETM(多色分析和高速分选流式细胞仪)、LSR II(数字化分析型流式细胞仪)。

FACSCount为精确计数淋巴细胞CD3,CD4,CD8绝对数而设计的。FACSCalibur是全自动多色流式系统,偏重于临床,其整体设计帮助临床医生快速实现常规免疫表型、CD4T细胞计数、DNA、网织红细胞、血小板等临床分析,兼具分选功能。配备有二根激光管,可同时检测4个荧光参数。可识别粘联细胞。

BD FACSA ria流式细胞分选仪为台式高速细胞分选仪,获取速度达70,000细胞/s,分析速度达50,000/s。使用石英杯流动检测池固定光路校准技术。使用三种激光,多色分析,分析参数可达15色。两管或四管分选,可以使用多种规格的收集管。液流监测系统白动监测液流断点,检查堵塞,实现了细胞分选的无人操作。配件BDACDU装置,可以在微孔板或载波片上定量分选细胞。

FACSV antage SETM是在FACSV antage的细胞分选功能基础上推出的分选增强型流式细胞仪。六色荧光分析系统,点对点分选,配置FACS Diva数字化系统,提供全面的配套试剂。速度和功能优于FACSV antage。 BD LSR II是LSR的数字化升级版,其性能介于FACSV antage SE和FACS Calibur之间,是专为生命科学研究设计的台式机。配备固定校准的紫外激光,四种激光立体空间激发、十色荧光同时分析、电子系统数字化、比较易学易用。

3.2 Beckman-Coulter公司流式细胞仪介绍 Beckman- Coulter公司生产的流式细胞仪以Profile(早期,现已停产)和EPICS系列为代表,近年又推出了Cytomics FC500系列。EPICS系列是大型流式细胞仪,目前市场上有XL、XL-MCL和ALTRA三种型号,其中ALTRA具有分选功能,适用于免疫学、细胞生理、分子生物学、遗传学、微生物学、水质分析和植物细胞分析。Cytomics FC500系列流式细胞仪体积小,可自动进行5种颜色的分析,适用于免疫学检测,如人类HIV诊断。特别是FC500MPL的独特设计可以在同一系统上使用12×75mm的离心管和24或96孔的平板。特别适合工作量大的实验室。

这二个公司主要针对医学研究和临床工作进行设计和生产,其产品可应用于生物医学基础研究以及临床检

测的许多领域,如遗传、肿瘤、血液、免疫等诸多研究中红细胞、T细胞、淋巴细胞亚群测定、检测早期细胞凋亡、肿瘤细胞免疫测定等。这二个公司的流式细胞仪价格昂贵,我国主要购买、使用的单位基本上都是一些医疗机构。

3.3 Partec公司流式细胞仪介绍 与BD和Becman-Coutler公司的产品相比,德国Partec公司生产的流式细胞仪的共同特点是体积小,造价低,易操作,便于携带,适合植物学研究,适合边远地区和发展中国家。德国Partec公司的产品分为三类:CCA家族、PAS家族和CyFlow家族(Galaxy为早期产品,已停产)。CCA家族包括细胞计数分析仪CCA和倍性分析仪PA-I。它是单或双参数的台式小型机,可以进行一些常规分析,如核DNA测定(检测倍性或细胞周期)、细胞计数、细胞凋亡。它的特点是体积小,易操作,价格低,检测范围广,可以检测多种荧光素(如PI、DAPI、Fluorescein)发出的荧光。PAS家族包括粒子分析系统PAS、粒子分析系统III(PAS-III)和倍性分析仪PA-II。提供三种激光器的三种组合,可检测十余种荧光染料。最多可检测和记录八个独立荧光参数。倍性分析仪PA能够在2分钟内自动测量植物的倍性水平,检测异倍体。可以对叶片、幼苗、种子、果皮、根、花等植物材料进行分析。在大多数植物中,异倍体染色体的检测分辨率为±1条染色体。PA-I使用HBO-100汞灯,属于弧光灯,可产生紫外激发光和蓝光。PA-II中增加了488nm氩离子激光器,能够检测几乎所有的荧光染料,如DAPI,Hoeehst,PI,EB,MMC,FITC,FDA等。汞灯发光是电流经过气体时,气体电离产生的。它能提供最佳的激发波长。

CyFlow(R)SL配备三种激光管,可应用于诸如人类健康、微生物学、工业应用、过程控制、生态学等研究。如HIV扫描中免疫标记细胞计数、食品处理过程中的微生物计数、细胞凋亡等。它使用l2 V直流电,特别适合边远地区和发展中国家。

国际上20世纪80年代开始将流式细胞仪检测应用到植物的研究中(Galbraith,1983),众多学者都认为流式细胞仪是一种准确、快速的检测DNA含量的方法(Michaelson,1991)。应用范围主要是利用流式细胞仪研究属内、属间多种植物的DNA含量(Baird,1994;Jacob,1996;HALL,2000)和倍性水平(Costich,1993;Meng,2002)、检测体细胞杂种(Pfosser,1995;Keller,1996)和游离小孢子培养再生株(Kim,2003)的DNA含量。过去我国应用这一检测技术的植物研究工作者寥寥无几,且大多是在国外实验室完成的。研究内容包括植物生理、程序性死亡、倍性鉴定等。植物研究中使用的流式细胞仪基本上都是Partec公司的产品,也有少量是BD公司生产的流式细胞仪。BD公司的产品主要定位于医学研究与应用,与Partec产品相比,不太适合从事植物染色体倍性的鉴定。主要体现在不能提供植物样品制备技术/试剂,数据获取软件可同时检测到的倍性数目少。鉴于目前我国科研院所中使用较多的是BD公司生产的流式细胞仪,在下一篇中将会对利用BD流式细胞仪进行植物倍性检测的技术和技巧做详细报告。



如何选择流式细胞仪


自七十年代出现第一代流式细胞仪以来,随着计算机技术、电子制造技术、激光技术及荧光素合成技术的不断发展,现代流式细胞仪已今非昔比,制造工艺、功能、精确度有了质的飞跃。

流式细胞仪生产厂商推出各种不同型号的流式细胞仪来满足用户的不同需要。现生产流式细胞的厂商全球至少有六家,各厂商产品又有不同的系列,各具特点。如何从众多的型号中挑选出最适合自己的机型,我们还需从分析应用出发,评估自己的需求来决定什么样的流式细胞仪最具性价比、最适合自己。 ⑴、DNA倍体分析

DNA分析是流式细胞仪最初且是现在应用最广检测项目。由于恶性细胞DNA含量通常与正常细胞不同,存在异倍体细胞,所以现有很研究评价异倍体细胞与肿瘤恶性度及其预后的关系。DNA含量检测还可提供细胞周期方面的信息,这在细胞生物学中运用很广泛。特别地,它可表示出细胞毒性药物对细胞作用过程。这些DNA检测还可与细胞表面标志物标记同时进行,这样在细胞混合培养中,可通常追踪表达特异标志物的细胞显示其生长周期情况。所有方法都是基于染料能与核酸起特异的化学反应并发射出荧光,常用的染料为PI,DAPI。

流式细胞仪要求:488nm光源,575nm滤光片。

⑵、细胞生存能力实验

使用Heochest 33342染料与DNA特异性结合,后因细胞活力不同,染料的结合程度也各异,故可评估细胞的活性度。

流式细胞仪要求:360nm光源,455nm滤光片。

⑶、计数外周血中检测网织红细胞

使用TO染料能够特异性地与RNA结合,结合系数高达3000,故具有很好的性价比。

流式细胞仪要求:488nm光源,525nm滤光片,液量绝对计数系统。

⑷、外周血、骨髓采集物中CD34阳性干细胞计数,临床上用于骨髓移植前干细胞数理的测定

使用标准ISHAG方案,需要DNA或其他核染料占用FITC通道,PE标记CD34抗体,PE-CY5标记CD45抗体。 流式细胞仪要求:488nm光源,525nm、575nm、675nm滤光片,液量绝对计数系统。

⑸、交叉淋巴细胞、粒细胞毒实验

检测识别供体血清中免疫球蛋白与受体粒细胞之间是否存在反应有着重要临床意义,因为这种反应会导致移植后发热、移植后肺损伤及免疫性粒细胞缺乏症。流式细胞仪可检测全血样本与血清孵育后粒细胞上结

合的人免疫球蛋白。FITC标记人免疫球蛋白抗体、PE标记粒细胞表面标志物、PE-CY5标记HLA抗体。 流式细胞仪要求:488nm光源,525nm、575nm、675nm滤光片。

⑹、血小板自身抗体检测

血小板自身抗体识别人血小板抗原,会引起各种临床相关症状,如新生儿自免性血小板减少症、输血后紫癜、难治性血小板减少。流式细胞可快速准确地检测血小板自身抗体。FITC标记抗人免疫球蛋白抗体、PE标记识别血小板抗体。

流式细胞仪要求:488nm光源,525nm、575nm滤光片。

⑺、移植交叉配型

原细胞毒实验,主要用于避免移植物超急性排拆反应。流式细胞仪用于监测T或B细胞是否受到受体血清中免疫球蛋白攻击,作为HLA配型前的预实验。流式细胞仪因其高精确性已成为该领域内的金标准。FITC标记抗人免疫球蛋白抗体、PE标记识别T细胞CD3或B细胞CD29抗体。

仪器要求:488nm光源,525nm、575nm滤光片。

⑻、检测细胞经抗原或细胞有丝分裂刺激后活化效应

淋巴细胞早期活化指标CD69可用来检测免疫治疗效果。流式细胞使用三色分析可监测淋巴细胞各亚群活化情况:FITC标记的CD3抗体、PE标记的CD8抗体、PE-CY5标记的CD69抗体。

流式细胞仪要求:488nm光源,525nm、575nm、575nm滤光片。

⑼、检测细胞内因子(TH1/TH2细胞检测)

未活化的淋巴细胞所分泌的细胞因子极少,用流式细胞仪很难检测出来,因此在检测前需刺激活化。活化所用的刺激素为PMA 佛波酯+Ionomycin。淋巴细胞在刺激素的作用下,活化分泌细胞因子到细胞外。因流式细胞仪只能对细胞表面或内部的抗原进行检测,如细胞因子分泌到细胞外则检测不到,因此必须阻止细胞因子的分泌。抑制细胞因子分泌的试剂为Brefedlin A或Monensin。Th1/Th2细胞首先是CD4+T细胞,因此存在着用CD4来设定细胞群的问题。我们知道CD4不但在T 细胞上表达,还在所有的单核细胞上表达,因此单独用CD4设门无法将CD4+T细胞区分开来。那么我们用CD3和CD4双参数设门是否可以呢?回答是否定的。因为在佛波酯的刺激作用下CD4 抗原的表达会迅速下调,甚至完全丧失,所以不适合于设门。用CD3和CD8设门,因CD8不受佛波脂的影响且绝大多数CD3+CD8-的细胞都是CD3+CD4+细胞,因此可用CD3+CD8-细胞群来确定CD4+T细胞群。FITC标记CD8,PE标记IL-4和,PE-CY5标记IFN-r,APC或PE-CY7标记CD3。

流式细胞仪要求:488nm或633nm(仅限APC染料)光源,525nm、575nm、675nm,767nm滤光片。 ⑽、细胞增殖状态检测

核增殖抗PCNA、Ki67、BrdUrd用于衡量细胞增殖分裂状况,在评估肿瘤预后有重要意义。


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