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FAQs
RPA常见问题汇总
作者:Moreybio 发布时间:2016-10-17 点击次数:540

关于引物的问题                                                                         

 

PCR 引物可以用于 RPA 吗? 可以。我们最近已经证实,在许多情况下,具有 PCR常用长度

(例如 18-23 个核苷酸)的引物可很好地用于 RPA。不过要注 意,反应动力学可能会稍慢,因此如果想要发挥RPA的优势,在 10-15 分钟内快速扩增,我们建议使用稍微长一些的引物(以及 更短的扩增子)。此外还要注意,对于决定寡核苷酸作为 RPA 引物的因素与决定寡核苷酸作为 PCR 引物的因素两者之间的关 联,目前尚无正式定论。

 

我可以使用现有的 PCR  探针吗?

不可以。大多数常用的 PCR 探针系统不适合用于 TwistAmp® 检测过程。具体地说,那些利用聚合酶的 53核酸酶活 性的系统不能用于 TwistAmp® 系统,因为这种酶活性与 RPA 生物化学过程根本不相容。

 

我如何设计 RPA  引物?

可以通过官网上附录(网址为 twistdx.co.uk)中详细介绍的筛选 过程确定好的RPA引物。

 

我需要使用多少引物?

TwistAmp® Basic 反应的推荐引物浓度为每种 480nM 对于 TwistAmp® exoTwistAmp® fpg  Twist Amp® nfo  试剂盒,推 荐引物浓度为每种 420nM不过,稍微改变反应中某些引物对 的用量可以提高其性能,可采用滴定策略(每次从 200nM 600nM)来确定其特定引物对的最佳浓度条件。


 

文本框: twistdx.co.uk我如何配置冻干探针? 请参照寡核苷酸生产商关于探针配置和贮存的说明。

 

通常,将装有冻干寡核苷酸的小管短暂离心以使 DNA 沉降于 小管的底部,加入适量的 T0.1E   缓冲液(10mM Tris-HCI     pH 8

0.1mM EDTA)来制备 100μM 的贮备溶液。将溶液在室温下 静置 10 分钟,并混合(震荡)10 秒钟。配置好的寡核苷酸探 针通常可在 -20°C  下长期贮存。

 

我需要使用多少探针?

反应中探针的推荐浓度为 120nM。不过,略微改变探针的浓度 有时会促进 TwistAmp® 反应。对不同的探针浓度(从 50nM 150nM)进行测试将优化基于探针的特定检测的性能。

 

RPA 引物需要多长?

为了充分利用 RPA 的检测速度和灵敏度,我们建议客户使用至 少 30   个核苷酸长度的引物。通常情况下,引物长度在 32   35 个核苷酸之间。可使用较短的 PCR 长度引物,但是这类引物 的检测速度和灵敏度可能不及较长的引物。

 

RPA 引物应当相距多远? 这取决于具体应用和需求。一般而言,我们建议在标准 TwistAmp® 试剂盒检测条件下,两个 RPA 引物产生的扩增子 长度通常不应超过大约 500bpRPA 扩增产物的大小或许没有 下限,不过根据RPA 引物的最小长度, 扩增子长度最小大约 80bp。为了获得最快速的实时反应动力学,最终扩增子的理想长 度应为 100-200bp。在特别优化的情况下,生成的扩增产物长达 2kb。但是,标准的 TwistAmp® 试剂盒不容易产生这么长的扩增 子。请参阅附录(网址为 twistdx.co.uk)了解有关引物设计和获


 

文本框: twistdx.co.uk得更长扩增子方法的详细信息。

 

我需要筛选多少引物? 这取决于您对检测灵敏度的要求。举例来说,如果您只需要每个 反应检测 1000 个分子或以上,那么绝大多数引物对都够用了。 对于极高灵敏度的检测,最好是进行系统性的引物筛选以找到 好的 RPA 引物。最初筛选时,测试的引物对数量通常在 10 20 对之间。测试的寡核苷酸越多,找到能够在快速动力学下检 测单个分子的好引物对的几率也就越大。 我可以在哪里获得有关引物设计的更多详细信息? 有关引物设计的更多详细信息,请参阅附录(网址为 twistdx. co.uk/support

 

我需要使用探针筛选引物吗? 不需要。任何检测方法都可以用来评估和比较候选引物对的性 能。不过,就筛选高灵敏度的引物而言,用检测探针对扩增进行 实时监控被证明是最快也是最省力的方法。

 

筛选引物时我应该使用什么样的条件? 理论上,引物筛选的条件应尽可能接近地模拟最终检测时所要求 的条件(近似的模板拷贝数、样本纯度、多重检测深度等等)。

 

可以提高给定引物的性能吗? 稍微改动一下引物的序列可以提高 RPA 性能。任何给定的引物 都可以通过以下方法进行优化:以单核苷酸为基础略微改变引物 的长度;以及保持引物长度不变,以 1bp 为增量移动引物的位 置。经过改动的引物,需要重新进行扩增活性的测试。


 

文本框: twistdx.co.uk怎样才算是好引物? 目前对于好引物还没有确切的设计标准,所以需要进行筛选。

 

RPA 引物的解链温度应该是多少?

由于 RPA 反应是在恒温和 DNA 解链蛋白彻底改变 DNA 的解 链行为的条件下进行的,因此传统的估算的解链温度不直接适用 于该系统。

 

我该如何选择探针?

如果使用适用于探针的其中一种 TwistAmp® 试剂盒,请参照附 录(网址为 twistdx.co.uk)中描述的有关检测探针的设计指南。 需要注意的是,使用首选的 TwistAmp® exo 探针系统在标靶区 域中选择探针位置时,有一些序列限制。如果存在不合理的限 制,TwistDx 可帮助您设计备选检测策略。备选的 TwistAmp® fpg 探针系统更容易提供灵活的探针设计,但它产生的荧光信号 有时不如 TwistAmp® exo   探针强。

 

引物需要进行任何特别纯化吗? 在进行引物筛选的时候,通常不需要使用特别纯化的寡核苷酸。 但与用于其他技术时一样,我们注意到了引物制备质量的 批间差异。因此,对于一致性要求比较严格的应用,我们建议在 确定了好引物之后使用更纯的引物。

 

经过一种 TwistAmp®    试剂盒测试的引物,能直接用于其他

TwistAmp® 试剂盒么?

不一定。如果您已使用 TwistAmp® Basic 试剂盒设计了引物, 用于 TwistAmp® exo nfo 试剂盒时您还需要引入探针。这个 和其他因素意味着跑胶检测、荧光检测或侧流层析检测对引物的 最佳组合可能有不同的要求。通常情况下,我们发现,使用相似


 

文本框: twistdx.co.uk序列的探针从 TwistAmp® exo 荧光检测转为 TwistAmp® nfo 侧 流层析检测能够获得相当可靠的结果。但是荧光检测的最佳引 物/探针组合不一定是能够提供最令人满意跑胶检测结果的引物 组合,反之亦然。从 DNA 检测分析转为 RNA 检测的逆转录 分 析的情况更为复杂,因为逆转录酶和聚合酶对引物有着不同的偏 好。就这一点而论,我们建议使用逆转录系统在 RNA 模板上设 计 RNA   检测,而不是在使用 DNA   试剂盒优化后尝试转为使 用 RT  试剂盒。

 

能直接用标记的引物和 TwistAmp® Basic 剂盒进行侧流层析检 测吗? 可以。您可以根据需要使用两个经过修饰的引物来进行侧流层 析检测,但我们推荐使用探针和 TwistAmp® nfo  试剂盒。这是 因为 RPA PCR 一样,会受到引物二聚体形成的影响。如 果引物设计不完美,引物很容易发生交叉反应,生成假阳性结 果。TwistAmp® nfo  探针能够避免这个问题,因为它们被封闭, 所以无法延伸形成探针-引物二聚体。nfo 酶只有在与互补链结 合时才能识别并切除无碱基位点 (THF)。切除无碱基位点意味 着,探针的封闭端可以脱落,探针可以充当引物,从而生成可被 侧流层析试纸条检测到的产物。因此,只有获得所需的扩增子, 探针才能结合、被切割并延伸以形成带有反向标记引物的产物。

 

RPA  支持生物素或荧光标记的寡核苷酸吗?

支持。在 RPA 反应中,连有生物素或荧光团的引物与未修饰的 引物表现差不多。我们还没有发现任何差异。


 

文本框: twistdx.co.uk 多重检测                                                                                   

 

TwistAmp® 反应能实现多重检测吗? 可以。可以在同一个管中同时进行多个扩增反应。不过,多重化 的引物对组合需要精心设计,以便每个引物对都能同样有效地工 作。需要注意的是,反应中的寡核苷酸总量 (nmol) 不要明显 超出实验方案中规定的量;如果在一个反应中使用两个以上的扩 增引物,则应在所有存在的寡核苷酸之间分配不同引物的最大用 量。另外,同时监控多个扩增事件也需要不同的探针;多重检测 对检测设备以及荧光团兼容性的限制也必须予以考虑。

 

 定量                                                                                          

 

可以利用 TwistAmp® 反应对模板定量吗? 可以。特定检测的扩增子达到可检出水平的时间,取决于反应起 始时的模板量:初始模板的拷贝越多,扩增子就越快达到可检 出水平。不过,利用这种基于时间的定量需要精心的实验设 计,确保对照反应是同时开始的(例如,可以通过镁离子的添 加进行控制)。相对较慢的扩增反应有助于更精确的定 量。减慢扩增反应速度的策略(包括合适引物的设计)在附录( 网址为 twistdx.co.uk)中讨论。

 

 Twista  兼容性                                                                       

 

可以在 Windows 8  设备上运行 Twista®  吗?

Twista®  Windows 8  系统不兼容,因此您必须安装 Windows

早期版本(XP  Vista  7)的仿真程序才能运行 Twista


 

文本框: twistdx.co.uk 设置                                                                                          

 

试剂盒在运输时处于常温,它还能使用吗? 可以,试剂盒处于常温下 2-3 周不会有问题,仍然可以使用。 如果您不确定,请运行对照测试并将结果发送给我们,我们将 能确定实际情况是不是这样。对于长期贮存,我们建议贮存在

-20˚C  下。

 

可以将再水化溶液的每一种成分直接依次添加到冻干的反应球 团中吗? 不可以。将一种引物或探针先于另一种加入体系将会导致重组复 合物的形成偏向先添加的寡核苷酸。这就是引物和探针必须同时 添加的原因。

 

可以将醋酸镁添加到重悬缓冲液中吗?

如果您在使用 TwistAmp® Basicnfo fpg 反应体系,是可以 添加的。 不过一旦加入镁离子,反应组分就被激活。在最后用移液器将醋 酸镁移取至反应中时,我们建议可将醋酸镁添加到联排反应管的 盖子上并将其离心旋转至反应体系中,如此您便可确保反应同时 开始,并将交叉污染或移液枪头上残留的任何反应残液生成 RPA 产物的风险降至最低。

 

如果您在使用 TwistAmp® exo TwistAmp® exo RT 反应体系, 则不可以添加。在有镁离子存在时,引物和探针在受到重组酶和 单链结合蛋白保护之前可能被核酸外切酶破坏。这可能会导致反 应中出现很高的荧光基线。


 

文本框: twistdx.co.uk可以制备预混液吗? 可以。如果您想建立多个反应,可以制备预混液。在筛选不同的 DNA 时,可以将重悬缓冲液、引物和探针(如使用)混合在一 起,并加入到冻干的反应物中进行重悬。然后将不同 DNA 加入 反应体系,最后照常用 MgAc 起始反应。在进行引物筛选时, 可以用重悬缓冲液、模板 DNA、探针(如果使用)和一个引物 制成预混液,并将其分装到 1.5 ml 小管之后再分别加入不同的 引物。只有当两个引物都存在时,才能重悬冻干的反应物,否则 会使重组复合物的形成偏向先添加的寡核苷酸。

 

 运行 RPA  反应                                                                       

 

TwistAmp®      试剂盒应在怎样的温度下使用?

标准的 TwistAmp® 试剂盒经过配置可在 37°C-42°C 的温度范围 内操作。过高的温度会对反应体系产生不利的影响,因为酶会逐 渐地失去全部活性。在适当的条件下,RPA 过程本身可以在较 低的温度下进行,但所提供的 TwistAmp® 试剂盒的制剂已针对 高反应动力学速度进行了优化,通常不兼容使用低于推荐范围的 温度条件的检测方案。对于 RT 试剂盒,我们建议用户在 40°C 下运行反应,因为逆转录酶在稍高的温度下具有更高的活性。

 

如果要运行 TwistAmp®  反应,必须使用 Twista®  吗?  不需要。 TwistAmp® Basic nfo 试剂盒适用于任何能够保持 37-42°C 的稳定温度的设备。对于使用 TwistAmp® exo 试剂盒 进行的实时反应,可使用能激发并检测所用荧光发色团并能保持 37-42°C 稳定温度的任何孔板检测仪或实时热循环仪。注意,在 运行 RPA  反应时,盖加热功能应关闭。


 

文本框: twistdx.co.uk可以使用 TwistAmp® Basic 反应的扩增子进行 TA 克隆吗? TwistAmp® Basic 反应中使用的聚合酶不具有编辑功能,扩增子 应该是可以用于 TA  克隆的。不过,我们尚未对此进行过测试。

 

可以在反应体系中加入更多/更少的再水化缓冲液吗? 不可以。加入比建议量更多或更少的再水化缓冲液会对 RPA 反 应的进行方式产生不利影响。缓冲液中包含 RPA 反应所需的成 分,因此加入更多或更少的缓冲液将会改变其在重悬球团中的最 终浓度。

 

 检测                                                                                          

 

可以对扩增反应进行荧光终点分析吗?

可以,但不包括使用 TwistAmp® exo 试剂盒或 exo RT 试剂盒的 情况。因为在扩增停止后,反应混合物中的核酸外切酶会消化掉 大部分的扩增产物。要分析扩增子,请使用 TwistAmp® Basic 试 剂盒。也可以对使用 TwistAmp®nfo TwistAmp® fpg 试剂盒 生成的产物跑胶分析。注意,如果您想对这些产物进行跑胶分 析,可将 TwistAmp®nfo 试剂盒与 TwistAmp® exo 探针结合使 用,但反应动力学速度会变慢。

 

可以使用插入性染色剂 实时监控TwistAmp®  吗? 可以。插入性染色剂可以在 TwistAmp® 反应中进行定量和监 控。不过,就像 PCR 一样,这种染料通常可以结合到任何双链 DNA 上,因此引物噪音会产生假阳性信号。引物噪音在较低的 温度下会更严重一些,而在 PCR 检测中,测量插入性染料时的 温度通常是引物二聚体熔解时的温度。此外,TwistAmp® exo  试 剂盒中的核酸外切酶会在反应过程中消化大部分的扩增产物,因 此不推荐将插入性染料用于这类试剂盒。


文本框: twistdx.co.uk跑胶之前需要回收 RPA  产物吗?

需要。RPA 反应体系里的集聚试剂和蛋白会干扰正常的琼脂糖 凝胶电泳,如果不进行反应产物回收,跑出来的可能是弥散条带 而不是干净的条带。

 

在用侧流层析试纸进行检测之前需要稀释 RPA 产物吗? 需要。RPA 反应体系里的集聚试剂和蛋白会干扰侧流层析试纸 上的抗体,如果不进行充分稀释就会出现非特异性结合和假阳 性信号。

 

TwistAmp® exo (RT) 反应即将结束时,有时会看到荧光急剧 增强,这正常吗?

正常。在 TwistAmp® exo 反应中,聚合酶和核酸外切酶 III 处 于竞争关系。随着反应的能量逐渐耗尽,核酸外切酶 III 开始 占据优势,结果导致探针更快速地裂解和荧光信号出现剧增。

 

 

可以保存 TwistAmp®    反应产生的扩增子吗?

可以,TwistAmp® Basic  nfo  反应体系的扩增子短期可以保存 在 4°C  下,长期保存在 -20°C   下。

 

TwistAmp® exo (RT) 反应的扩增子不能保存。如果在反应停止后 未经迅速的失活处理,核酸外切酶 III 很可能会消化扩增子。


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