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培训资料
基于TFF的杆状病毒载体纯化方法
作者:Moreybio-NO1 发布时间:2017-01-05 点击次数:1390

  重组杆状病毒(rBV)是新型的体内和体外基因转染载体,其介导的转基因技术已广泛应用于药物筛选、肿瘤治疗以及组织工程等领域。此外,rBV囊膜可用于蛋白质/多肽展示,即其可作为疫苗递送平台。

  优化重组杆状病毒,以作为哺乳动物细胞基因转染工具的主要驱动力,是相比现有的基因导入载体,其具有诸多优势,如对哺乳动物宿主无致病性、可容纳更大量的外源基因插入以及可使用昆虫细胞系稳定生产高滴度的产物。

  

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  但是杆状病毒与众不同的特性,特别是表面异质性和非球形的棒状结构,对于建立稳定的下游工艺提出了较大的挑战,特别是临床级产品的制备。而且,为达到目的治疗效果,体内临床应用需要大量的病毒载体,并需有效去除污染物,后者可能会抑制转导效率、导致宿主免疫反应、形成不必要的负作用。对效价和质量的要求,使重组杆状病毒的生产,需要使用高效、可放大的纯化和浓缩方法。

  往常,收获细胞培养液后,重组杆状病毒的纯化和浓缩需要一系列的离心/超速离心步骤。但是,超速离心方法相当耗时耗力,且容易导致感染力显著下降,原因可能是病毒颗粒形成了不可逆的聚集,所以使用这种方法时,通常会出现低回收率、低重复性的结果。也有实验使用体积排阻或阳离子交换层析进行纯化,或使用磁珠对生物素化的载体进行浓缩,但在效率和可放大性上总有所欠缺。

  

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  进入临床应用时,动物细胞培养来源的杂质是主要问题之一,包括宿主细胞DNA、宿主细胞蛋白以及内毒素。用于临床实验的病毒载体,如腺病毒或逆转录病毒,都需要多种下游纯化步骤的结合,包括浓缩、捕获及精制等,以将这些杂质降低至可接受的水平。

  本文介绍一种基于膜技术的简单、稳定、经济的重组杆状病毒下游纯化策略,包括澄清、浓缩/洗滤等,其可显著降低工艺时间和验证成本,并便于向cGMP操作进行转化。

  实验

  Sf-9昆虫细胞摇瓶培养,扩增后转移至25L波浪式生物反应器。感染时活细胞浓度为1-2x10^6cells/mL,重组杆状病毒感染复数约为每细胞0.1PFU。细胞活性至50%时,收获病毒生产料液。

  

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  下游澄清使用0.65μm孔径的mPES中空纤维切向流过滤膜,从含有重组杆状病毒的上清液中去除较大的细胞颗粒及聚集物。然后再使用100kD中空纤维超滤膜浓缩至100ml后,再以D-PBS缓冲液进行洗滤换液。两步操作均使用KrosFlo切向流过滤系统,通过KF Comm数据采集软件记录进样、回流及滤液压力等完整操作参数,同时在两步操作中,通过自动背压阀,分别控制滤液或跨膜压力恒定,并根据实时剪切计算,调整循环流速,以维持病毒完整性及活性。

  

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  之后以阴离子交换膜层析进行病毒捕获,再脱盐、除菌过滤后获得所需终产物。

  实验使用RT-qPCR以及流式细胞术分别检测总病毒及感染性病毒滴度,并以HepG细胞系用作靶细胞系,检测病毒转导效率。此外,每步纯化步骤后,使用SDS-Page和WB检测样品中蛋白含量。内毒素水平使用LAL法测试,并用电镜分析rBVs完整性及形态,动态光散射法检测样品颗粒的水动力学粒径。

  结果

  使用中空纤维切向流微滤进行澄清可替换离心,且结合使用可抛弃型封闭流路,可维持料液的无菌状态,防止污染。由于杆状病毒颗粒较大(60 x 300nm),选择较大的孔径可降低过滤器内可能的病毒聚集和截留。 该步感染性病毒颗粒回收率可达>95%。

  对于病毒产品的大规模纯化和浓缩,切向流过滤是最常用的技术,其可同时降低低分子量杂质的含量。 操作时,最佳循环流速和跨膜压等操作条件都需通过实验优化,以降低膜污染及由其导致的产物损失。在杆状病毒处理中,通常需控制TMP<10psi,避免膜表面凝胶层的快速形成。在优化的条件下,病毒回收率可达>75%,浓缩因子可达10倍以上。此外,虽然有报道显示重组杆状病毒对剪切应激的耐受性较好,但其仍是需要控制的主要条件之一。

  在澄清及纯化浓缩之后,为达到体内/外临床测试的质量要求,产品需进一步处理,根据病毒特性,可使用离子交换工艺。

  多个批次间的重复实验确定了该方法的可重复性和稳定性,工艺总回收率及终产物纯度与使用传统方法相当或更优,而切向流过滤的其它优势,还在于更短的时间内处理更大量的料液及可抛弃型使用,有利于cGMP操作。

  KrosFlo Research 2i (KR2i)切向流过滤系统

  

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  仕必纯KrosFlo Research 2i (KR2i)切向流过滤系统是仕必纯新近推出的新一代全整合式切向流过滤系统,系统采用高精度蠕动泵,并整合了数据采集软件,可实时监测完整工艺参数,方便记录、分析和优化,保证工艺可重复性,并便于工艺放大。

  系统流路采用标准接头设计,可兼容不同构型的超滤、微滤单元,即可在一个系统上,完成多个步骤的操作。如采用仕必纯定制式、可抛弃型流路,更可保证工艺无菌性,避免污染,简化操作。


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