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引物探针设计

                     RPA引物筛选及设计

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RPA最长可扩增1500bp左右长度,但取决于反应条件。标准的AMP试剂盒对反应速度进行了优化,目的片段只适合低于500bp的扩增子,最适100-200bp左右,最低70-80bp。

RPA的引物筛选主要分为以下几步:选择靶标区域,设计候选引物,筛选候选引物,提升性能再次筛选。引物筛选的条件最好尽量模拟实际检测时的条件,例如模板的拷贝数、样本纯度等等。取决于你对检测灵敏度的要求。举例来说,如果目标分子上千,那么绝大多数引物都够用了。对灵敏度要求很高的话,最好是进行系统性的引物筛选。一开始筛选的时候,候选引物可以有10到20对。测试的引物越多,找到好引物的几率也就越大。

引物设计原则:

1 5’端3到5个核苷酸避免聚鸟嘌呤,最好是胞嘧啶,能促进重组;

2 3’3个核苷酸是G或C有助于聚合酶的稳定性;

3 不要出现聚嘌呤和嘧啶;

4 GC含量在30-70%之间避免形成二级结构,发卡结构等;

5 靶标区域避开重复元件。

探针相关问题解答

筛选引物的时候必须用探针么?

不一定。任何检测方法都可以用来评估候选引物的性能。不过对于筛选高灵敏度引物来说,用检测探针对扩增进行实时监控被证明是最快也最省力的方法。

RPA反应需要用多少探针?

RPA反应一般每次需要120nM探针。不过,略微改变探针的浓度有时会促进反应的进行。我们可以在一定浓度范围内(从50nM到150nM),根据自己的具体应用对探针进行优化。

现成的PCR探针能用于RPA么?

不能。绝大多数常用的PCR探针并不适合RPA反应。特别是用到了聚合酶5’-3’核酸酶活性的探针系统,这样的酶活性与RPA根本不兼容。

使用引物和探针的时候还需要注意些什么?

引物和探针需要同时添加到体系中,一先一后会使片段重组出现偏向性。

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